目前已有6種基于嵌合抗原受體（CAR）修飾的免疫細胞的過(guò)繼細胞療法（ACT）被批準用于治療血液系統惡性腫瘤。與CAR-T細胞相比，CAR-NK細胞因其多種殺傷機制、更高的安全性和更廣泛的來(lái)源而受到越來(lái)越多的關(guān)注。誘導多能干細胞（iPSC）來(lái)源的NK（iPSC-NK）細胞具有成熟的表型和強大的細胞溶解活性，可以提供一個(gè)同質(zhì)的CAR-NK細胞群體，并擴展到臨床規模。因此，iPSC衍生的CAR-NK（CAR-iNK）細胞可以作為癌癥免疫治療的標準化和“通用型”產(chǎn)品。
NK細胞主要有四種來(lái)源：外周血、臍帶血、永生化細胞系（如NK-92）和誘導多能干細胞（iPSC）來(lái)源的NK細胞，其中外周血來(lái)源又可以分為自體來(lái)源和供體來(lái)源。下表總結了不同來(lái)源的NK細胞在免疫治療中的優(yōu)缺點(diǎn)。
表1 不同來(lái)源NK細胞在免疫治療領(lǐng)域的優(yōu)缺點(diǎn)
細胞來(lái)源
優(yōu)點(diǎn)
缺點(diǎn)
供體外周血
細胞成熟無(wú)需分化，已證明有臨床療效
分離困難，產(chǎn)量低
自體外周血
無(wú)同種異體反應
依賴(lài)患者免疫細胞質(zhì)量，擴增困難，滯后時(shí)間長(cháng)
臍帶血來(lái)源CD34+細胞
可大量體外分化
未成熟，細胞殺傷毒性小
NK-92細胞系
均一細胞群，無(wú)限擴增
不表達CD16，缺乏ADCC功能，安全性未知，輻照后效果減弱
iPSC
容易獲得，克隆生長(cháng)、高擴增及體外分化
安全性未知
目前尚不完全清楚iPSC-NK細胞是否需要相同的激活途徑來(lái)誘導脫顆粒和細胞因子分泌。盡管如此，大量數據證實(shí)了iPSC-NK 結合了原代 NK 細胞和 NK-92 細胞系最具吸引力的優(yōu)勢，即：高潛在的細胞毒性（包括 ADCC 功能）和即使冷凍保存后也能在體內擴增和持久存在的能力。
iPSC-NK細胞分化方案可以分為2D培養和3D培養兩種，兩種方式都需要通過(guò)誘導造血祖細胞（HPC）后獲得NK細胞。
01 iPSC-NK 2D培養
在最早的一種方案中，Kauffman團隊使用兩步體外2D分化方案，將人PSCs與小鼠骨髓基質(zhì)細胞共培養以促進(jìn)造血分化，然后將分選的HPCs與第二步的基質(zhì)細胞系和包括IL-15、IL-3、IL-7、SCF和Flt3L的細胞因子混合物共培養以產(chǎn)生PSC衍生的NK細胞。其他組已經(jīng)用表達Notch配體DLL1或DLL4的基因工程飼養細胞取代了第二步的基質(zhì)細胞系，這些工程改造的細胞可以促進(jìn)HPCs向NK譜系的分化和擴增
在2D培養方案中，飼養層體系因其高分化效率在基礎研究中應用廣泛。飼養層細胞能分泌生長(cháng)因子和細胞因子，促進(jìn)干細胞特定方向分化，為研究者提供豐富的細胞資源。然而，其在臨床應用中因安全性問(wèn)題受限，如可能攜帶病原體、引發(fā)免疫排斥等，因此，臨床研究者們更傾向于采用更為安全、可控的培養方案。
在非飼養體系中，干細胞的增殖和分化高度依賴(lài)于外源添加的細胞因子，通過(guò)在培養基中添加BMP4，VEGF，FGFb，TPO，IL-11，IGF-1，SHH，Transferrin等細胞因子，促使iPSC分化成為造血干細胞。然后添加IL-15，IL-3，IL-7，SCF，Flt-3L等多種細胞因子誘導其分化生成NK細胞。
02 iPSC-NK 3D培養
在3D培養方案中，iPSC在沒(méi)有飼養層（低吸附板）的懸浮液中培養時(shí)，它們會(huì )自發(fā)地形成擬胚體（EB），EB中的細胞響應外源性細胞因子信號，生長(cháng)和分化為特定的細胞譜系，在DLL4蛋白包被的板子和包含細胞因子的分化培養基中最終得到NK細胞。
iPSC分化為NK細胞的3D方案示意圖
通過(guò)無(wú)飼養層體系胚狀體形成方法將iPSC分化為NK細胞，簡(jiǎn)單的培養過(guò)程如下：未分化的iPSC細胞克隆使用TrypLE select處理后轉移至低吸附板，并在含有10μmol/L Y‐27632的iPSC培養基中孵育過(guò)夜，以形成胚狀體（EB）。收集EB并將其轉移到EB培養基中，并在40 ng/mL BMP‐4、10 ng/mL bFGF和50 ng/mL VEGF的存在下培養。第4天，EB與細胞因子混合物（50 ng/mL SCF、20 ng/mL Flt3L、20 ng/mL IL‐3和30 ng/mL TPO）一起培養。在培養的第14天，將分化的細胞轉移到FcDLL4包被的培養板上，并在細胞因子混合物（10 ng/mL Flt3L，5 ng/mL IL-7）的存在下培養。培養21天后，造血細胞分化為CD7+、CD45+淋巴細胞祖細胞（iLPC）。采集iLPC并用PHA刺激其擴增以產(chǎn)生iNK[5]（圖3）。
買(mǎi)試劑，找華雅，更多生物試劑，就在華雅思創(chuàng )，華雅思創(chuàng )生物提供PSC誘導分化NK細胞培養全流程中用到的一系列細胞因子，包括BMP4、bFGF、VEGF、FLT3L、SCF、TPO、IL-3、IL-7、IL-15等，以及iPSC培養常用Vitronectin、Laminins等基質(zhì)蛋白，高活性，高穩定性，高批間一致性，助力您的iPSC研究！
