當細胞破碎的時(shí)候，蛋白水解酶就會(huì )被釋放出來(lái)或被激活，使電泳結果復雜化，影響最終結果分析。為了避免這些情況的出現，建議在樣品制備時(shí)盡可能在低溫下進(jìn)行。此外，許多蛋白酶在PH9以上就失活了，因此Tris堿，碳酸鈉或堿性載體兩性電解質(zhì)往往能抑制蛋白水解。但是有些蛋白酶在上述條件下仍然保持著(zhù)活性，此時(shí)應當使用蛋白酶抑制劑。因此對于我們想要研究的蛋白來(lái)說(shuō)，選擇性和有效的抑制這些蛋白酶對于蛋白純化路線(xiàn)設計來(lái)說(shuō)顯得尤為重要。
蛋白酶抑制劑與蛋白酶一樣，都是紛繁復雜的，通常使用許多化學(xué)物質(zhì)作為蛋白酶抑制劑，如PMSF 和leupeptin。而且由于一種蛋白酶抑制劑只對某一類(lèi)蛋白酶起作用，因此通常建議復合使用蛋白酶抑制劑，如廣譜蛋白酶抑制劑“雞尾酒"，見(jiàn)下表（來(lái)自《蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗技術(shù)》）。
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蛋白酶抑制劑 |
有效抑制的酶 |
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PMSF(Pheylmethylsulfonyl fluoride)是很常見(jiàn)的抑制劑，使用濃度為1mmol/L |
不可逆抑制絲氨酸水解酶和一些半胱氨酸水解酶。 |
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AEBSF 絲氨酸抑制劑，使用濃度為4mmol/L |
AEBSF的抑制活性與PMSF相近，但它更易溶于水而且毒性低 |
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EDTA，EGTA，使用濃度為1mmol/L |
通過(guò)鰲合蛋白酶維持活性所必需的金屬離子來(lái)抑制金屬蛋白酶。 |
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多肽蛋白酶抑制劑，使用濃度為2-20ug/ml |
亮肽素（Leupeptin）能抑制多種絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶；抑肽素（pepstatin）抑制天冬氨酸蛋白酶；抑肽酶（aprotinin）能抑制許多絲氨酸蛋白酶；苯丁抑制劑（bestatin）能抑制氨基酸多肽酶 |
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TLCk，TPCK，使用濃度為0.1-0.5mmol/L |
不可逆的抑制絲氨酸和半胱氨酸的蛋白酶 |
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芐脒（Benzamidine）使用濃度為1-3mmol/L |
抑制絲氨酸蛋白酶 |
但是這樣配置溶液進(jìn)行處理，有時(shí)也是頗為麻煩，而且效果可能并不好，目前有一些廠(chǎng)家試劑在簡(jiǎn)便操作，和抑制效果方面有不俗的表現，可以考慮在實(shí)驗中選用，節約時(shí)間和便于結果分析。
比如，G-Biosciences的ProteaseArrest?蛋白酶抑制劑也許就能滿(mǎn)足這種需要，ProteaseArrest?是一種常規的蛋白酶抑制劑混合物，提供100X濃縮的即用溶液。這種100X濃度的溶液適用于小量，分析樣本的應用。在1ml樣本中加入10微升的ProteaseArrest可以達到大于95%的抑制效率。對于樣本中含量高的蛋白酶的情況，可以適當增加ProteaseArrest的量來(lái)達到更大的抑制效率。
抑制劑混合物包括針對絲氨酸、半胱氨酸、鈣蛋白酶和金屬蛋白酶可實(shí)現可逆和不可逆的抑制?？蛇x擇的EDTA的溶液可實(shí)現增強的金屬蛋白酶的抑制。EDTA并不存在于ProteaseArrest混合物溶液中，它將抑制那些需要二價(jià)陽(yáng)離子（Ca2+, Mg2+ 或Mn2+）來(lái)起作用的蛋白質(zhì)的活性。除此之外，EDTA會(huì )抑制那些通過(guò)使用固定金屬親和層析色譜純化得到的蛋白，也包括6XHis標簽重組蛋白。
由于各種抑制劑組分的*化的濃度，ProteaseArrest表現出優(yōu)異的蛋白酶活性的抑制，因而它適合在從動(dòng)物組織，酵母，植物和細菌中進(jìn)行蛋白純化和樣本制備過(guò)程中來(lái)保護蛋白。
ProteaseArrest也有獨立包裝的小包裝，能夠在10ml的溶液中達到大于95%的抑制效率。這種OneQuant?小包裝主要是為了科研人員方便使用。
實(shí)重要的是ProteaseArrest也可以根據實(shí)驗的情況來(lái)優(yōu)化蛋白酶抑制劑的濃度，比如組織中含有高于常規量的蛋白酶的時(shí)候，可以加入2X或者更高濃度的ProteaseArrest的量。
在研究中，發(fā)現1X濃度的ProteaseArrest的蛋白酶抑制效率達到了95%（0.5mg/ml的小鼠的胰腺提取物為例）。
除了蛋白酶抑制劑以外，在許多研究過(guò)程中，尤其是一些制藥公司和研究院在研究藥理學(xué)機制的時(shí)候，需要了解蛋白磷酸化途徑，因此一個(gè)重要的步驟就是準確的觀(guān)察一般和特異的磷酸化狀態(tài)，所以蛋白抽提的另一個(gè)重要保護過(guò)程就是對磷酸化狀態(tài)的有效保護。
磷酸化的蛋白可以被非特異性的磷酸酶（例如：堿性磷酸酶），特異性的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶、酪氨酸蛋白磷酸酶或雙重特異性磷酸酶去磷酸化。針對這種情況G-Biosciences也推出了一種PhosphataseArrest?磷酸酶抑制劑混合物，它能夠保持細胞和組織中蛋白的磷酸化狀態(tài)。PhosphataseArrest?包括3種抑制劑產(chǎn)品。
phosphataseArrest? I
一種廣泛的磷酸酶抑制劑混合物包括5種磷酸酶抑制劑，能夠特異性的抑制絲氨酸/蘇氨酸，和酪氨酸雙重特異性的磷酸酶。PhosphataseArrest? I是一種穩定的溶液組成，含有氟化鈉，正釩酸鈉，焦磷酸鈉，β-磷酸甘油，鉬酸鹽等。
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磷酸酶抑制劑 |
分子量 |
靶向磷酸酶 |
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氟化鈉 |
42 |
酸性磷酸酶 |
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正釩酸鈉 |
183.9 |
酪氨酸磷酸酶，堿性磷酸酶 |
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焦磷酸鈉 |
221.94 |
絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶 |
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β-磷酸甘油 |
306.1 |
絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶 |
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鉬酸鹽 |
205.92 |
酸性磷酸酶 |
PhosphataseArrest? II
一種廣泛的磷酸酶抑制劑混合物包括5種磷酸酶的抑制劑能夠抑制酸性，堿性和酪氨酸磷酸酶。PhosphataseArrest? II含有優(yōu)化濃度的氟化鈉，酒石酸鈉，正釩酸鈉，咪唑和鉬酸鹽。
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磷酸酶抑制劑 |
分子量 |
靶向磷酸酶 |
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氟化鈉 |
42 |
酸性磷酸酶 |
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正釩酸鈉 |
183.9 |
酪氨酸磷酸酶，堿性磷酸酶 |
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酒石酸鈉 |
230.08 |
酸性磷酸酶 |
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咪唑 |
68.08 |
堿性磷酸酶 |
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鉬酸鹽 |
205.92 |
酸性磷酸酶 |
PhosphataseArrest? III
一種廣泛的磷酸酶抑制劑混合物包括3種磷酸酶的抑制劑能夠抑制堿性和絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶。PhosphataseArrest? III是一種穩定的，方便的溶液，由斑蝥素，對溴四咪唑草酸鹽和腫瘤促進(jìn)劑組成。
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磷酸酶抑制劑 |
分子量 |
靶向磷酸酶 |
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斑蝥素 |
196.2 |
絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶 |
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對溴四咪唑草酸鹽 |
373.23 |
堿性磷酸酶 |
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腫瘤促進(jìn)劑 |
1009.17 |
絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶 |
總而言之，在實(shí)驗中適當的選擇一些經(jīng)過(guò)嚴格的質(zhì)量監控的產(chǎn)品，想來(lái)相比較于家制的雞尾酒而言具有更好的使用重復性，和有效性，讓我們在下游應用中得到更潔凈和清晰的結果。
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