全流程品質呈現(xiàn) | KAPA建庫產(chǎn)品助力新型冠狀病毒宏基因組研究
瀏覽次數(shù)：48發(fā)布日期：2021-02-04
2019新型冠狀病毒（2019-nCoV）疫情牽動著每一個人的心，目前除了一線疫情確認在進行大量檢測之外，溯源、復核、監(jiān)控疫情病毒變異的工作也在同步開展，在短期內，中國科學家以非凡的速度，分離并解析了新型冠狀病毒全基因組序列，為進一步分析其傳染機理，傳播途徑，藥物靶點等提供了最有利的支持，這一切的工作都離不開基于高通量測序的宏基因組病原體檢測。
宏基因組病原體檢測是對感染樣本進行文庫構建和高通量測序，通過病原數(shù)據(jù)庫比對，獲得致病微生物的種屬信息，對未知病原或已知變異較大病原進行識別，為傳染病防控帶來新的思路并提供指導臨床治療的報告。
根據(jù)提取核酸的種類不同，宏基因組病原體檢測分為DNA檢測流程和RNA檢測流程。
DNA檢測流程適用于胞內寄生的細菌如結核分枝桿菌、細胞壁較厚的真菌如隱球菌等病原的檢出。
RNA檢測流程適用于流感病毒、呼吸道合胞病毒、冠狀病毒等RNA病毒的檢出。本次新型冠狀病毒鑒定即是通過宏基因組測序RNA流程進行的。
病原檢測：未知病原微生物增加了臨床診斷難度，無法進行有效治療，導致患者病情加重甚至死亡。基于宏基因組學的測序在未知病原檢測中發(fā)揮日益重要的作用。
病原監(jiān)測與溯源：對特定地區(qū)或人群的臨床樣本進行宏基因組學測序，監(jiān)測潛在致病病原，對可能出現(xiàn)的疫情進行預測預警，對病原進行追溯，找到潛在傳播途徑，及時確定和切斷傳染源。
高通量測序病原宏基因組檢測的前處理環(huán)節(jié)只涉及核酸提取和測序文庫構建，不存在病原培養(yǎng)中出現(xiàn)的時滯，在病原微生物的檢測中有著明顯的優(yōu)勢，能夠更好應對臨床病原診斷需求，但是也依然面臨不少挑戰(zhàn)，其中，測序文庫構建最為關鍵并且難度最大。
先天不足：病原樣本深藏在大量宿主和其它微生物之內，臨床病原常為起始量低，背景噪音大的復雜樣本，大量宿主信號掩蓋了微量病原信號，致使敏感性偏低，難以有效區(qū)分。
后天潛憂：文庫構建涉及到基因組打斷，測序接頭鏈接，全基因組擴增等多個步驟，每一步驟的終極目標是要每個分子都以相同的效率執(zhí)行每個步驟，打斷有損失，連接有差別，擴增有偏好，都會帶來檢測誤差。
核酸機械打斷，損失較大，導致潛在病原信息丟失
連接效率較低，文庫構建中核酸分子多樣性和文庫復雜度的丟失，導致假陰性結果
建庫過程PCR步驟，特別是GC含量較高和較低的區(qū)段，擴增不均一，覆蓋不到位
文庫構建在宏基因組病原檢測中最重要的指標是核酸分子的復雜度和成庫產(chǎn)物的均一度，既要保證痕量目標病原的存在，又要保證目標病原不會因擴增過程的不均勻性比例過低，在后續(xù)測序中被遺漏。
宏基因組DNA檢測流程：KAPA Hyperplus酶切法DNA文庫構建試劑盒，無需機械法打斷儀器，樣本損失量小，操作簡單，可根據(jù)測序長度，進行片段大小調整，同時提供了更高的轉化效率及更低的擴增偏差(KAPA HiFi)，從而獲得更均一的全局序列覆蓋度。
宏基因組RNA檢測流程：正常起始量樣本，推薦采用KAPA核糖體RNA去除試劑盒 (人/大鼠/小鼠)去除宿主rRNA，之后采用KAPA RNA Hyper文庫構建試劑盒進行文庫構建。對于微量樣本，則推薦利用SMART-seq2方法反轉錄為cDNA，采用KAPA HiFi擴增cDNA，擴增后的cDNA再采用 KAPA DNA Hyperplus進行DNA文庫構建。
KAPA DNA和RNA建庫產(chǎn)品目前已廣泛應用在宏基因組病毒測序中，可參考文末文獻引用[4][5]。
復雜臨床病原樣本建庫效率高，確保病原的獲得[2]
文庫擴增覆蓋度、均一性好，PCR 重復度低，使得各種GC含量的病原均衡富集[1]
宿主rRNA去除效率高，顯著減少背景噪音，將更多測序reads用于病原而非宿主[3]
IVD級別質控，產(chǎn)品品質穩(wěn)定、批間差小，在大量各異的臨床樣本前表現(xiàn)穩(wěn)定
優(yōu)化建庫步驟，縮短實驗時間，快速獲得文庫用于后續(xù)測序[1]
完美兼容自動化工作站建庫方案，規(guī)?；瘧獙σ咔?/p>
文獻引用
1. Aigrain, L., Gu, Y., & Quail, M. A. (2016). Quantitation of next generation sequencing library preparation protocol ef?ciencies using droplet digital PCR assays-asystematic comparison of DNA library preparation kits for Illumina sequencing. BMC genomics.
2. Ring, J. D., Sturk-Andreaggi, K., Peck, M. A., & Marshall, C. (2017). A performance evaluation of Nextera XT and KAPA HyperPlus for rapid Illumina library preparation of long-range mitogenome amplicons. Forensic Science International: Genetics.
3. Herbert, Z. T., Kershner, J. P., Butty, V. L., Thimmapuram, J., Choudhari, S., Alekseyev, Y. O., ... & Gillaspy, A. (2018). Cross-site comparison of ribosomal depletion kits for Illumina RNAseq library construction. BMC genomics.
4. Deng, Y., Cai, W., Li, J., Li, Y., Yang, X., Ma, Y., ... & Sun, M. (2019). Evaluation of the genetic stability of Sabin strains and the consistency of inactivated poliomyelitis vaccine made from Sabin strains using direct deep-sequencing. Vaccine.
5. Grubaugh, N. D., Ladner, J. T., Kraemer, M. U., Dudas, G., Tan, A. L., Gangavarapu, K., ... & Prieto, K. (2017). Genomic epidemiology reveals multiple introductions of Zika virus into the United States. Nature.
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